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贴壁、悬浮、原代细胞感染专用Protocol及常见问题解答
  • 发布日期:2018-05-14      浏览次数:425
    • 慢病毒是当前zui热门的基因操作工具,其感染谱广,可有效地感染肿瘤细胞、神经元细胞、心肌细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而为基因功能的研究提供了更强有力的工具。然而仍有一部分细胞,尤其是原代细胞和悬浮细胞由于细胞特性,很难获得高效的感染效率。为了提高细胞的感染效率,我们常常选择多加病毒或使用Polybrene等助感染试剂,然而细胞状态却变差了,且增加感染效率并没有达到理解的效果,这是什么原因呢?
       
      一、对慢病毒感染出现的问题进行原因分析

      1. 细胞状态变差——细胞毒性 

       

      • 杂质病毒溶液中残留的杂质蛋白、内毒素及宿主细胞DNA等是造成细胞毒性的主要因素。特别对于某些外源刺激敏感的细胞来说,严重时将导致细胞死亡。这是病毒感染细胞后,状态差异的主要原因。
      • 过度感染:外源基因过度表达,会导致目的细胞本身正常新陈代谢失衡。这是有些细胞过感会死亡的主要原因。





      2. 病毒加了不少,效果不理想,如何增加感染效率——了解影响慢病毒感染效率的因素
       

      • 细胞膜的流动性
      • 细胞膜表面受体的表达丰度
      • 病毒与细胞的接触面积和接触几率
      • 细胞膜与病毒外壳蛋白电荷的多少

       
      二、如何有针对性地增加慢病毒感染效率

      了解了影响细胞状态和感染效率的原因后,我们就可以有针对性的进行调整。
       
      1.  使用高滴度高纯度的慢病毒,可以减少病毒中的杂质对细胞状态的影响:降低慢病毒对细胞的毒性
      2.  调整细胞状态,感染时使用对数期的细胞:增加细胞膜的流动性
      3.  降低感染时血清浓度,使用无血清/低血清的培养基:降低血清蛋白对病毒外壳蛋白的封闭
      4.  离心法,感染时将细胞培养板密封,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养:增加慢病毒与细胞的接触几率,但对细胞有一定的机械损伤,仪器要求高
      5.  感染时加入Rentronectin等纤粘蛋白:增加慢病毒与细胞接触几率,但会影响细胞的贴壁状态
      6.  使用传统的助感染试剂,如Polybrene:中和细胞膜和病毒粒子之间的电荷排斥,但Polybrene本身就具有细胞毒性,部分细胞对Polybrene敏感,容易导致细胞状态变差、形态发生变化、甚至死亡。

      三、特殊细胞慢病毒感染注意事项

      1. 悬浮细胞
          对于悬浮细胞,可采用离心感染方法提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。
       
      2. 极难感染的细胞
          对于极难感染的细胞,可采用多次感染的方法,即感染一次后,重新加入新鲜病毒再次感染,可显著提升感染效率。但需要注意调整两次感染间细胞状态。
       
      3. 传代能力较差的原代细胞、非分裂细胞

          原代细胞:由于细胞增长缓慢,可以在接种时提高汇合度到50%~60%,确保在感染后4天时细胞汇合度达到90%~100%;
          非分裂细胞:如神经元细胞,接种后不再增殖,需要按照100%的汇合度进行接种。 


       


      Q:慢病毒如何稀释?
      A:用常规培养基、生理盐水、Hanks液、PBS液等将慢病毒稀释到需要的滴度。如原病毒标记滴度为5 x 108 TU/ml,则取20 µl病毒液加入到80 µl的常规培养基中,即可得到1 x 108 TU/ml的病毒稀释液。
       

      Q:如何确定向细胞中加入慢病毒的zui佳时间?
      A:慢病毒感染细胞后需要4天的时间才能观察到慢病毒携带的基因表达,应在细胞汇合度20~40%时且细胞状态良好时加入慢病毒,确保在感染后4天时细胞增长达到90%~100%的汇合度。
       
      Q:加入慢病毒病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理?
      A:这种情况是由于慢病毒对该细胞有一定的毒性作用,需要调整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小时、8 小时、12 小时对细胞进行观察,若发现细胞状态变差时,则需要立刻对细胞进行换液操作,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
       
      Q:如何提高慢病毒对细胞的感染效率?
      A:慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响,如细胞自身生长的状态,细胞数量,细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖,轮廓清晰,合适的细胞密度,选择zui优的感染条件可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞,可采用离心感染方法,减少病毒感染时的体积,从而提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。

     
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