9号彩票

返回首页|加入收藏|联系我们

产品分类
联系方式

上海希言科学仪器有限公司
联系人:李经理
手机:13916220072
电话:86-021-61920961
地址:上海市松江区九亭镇涞寅路1025号立同商务广场3040室

您现在的位置:首页 > 技术文章 > 探究磁珠法蛋白纯化失败的真相
探究磁珠法蛋白纯化失败的真相
  • 发布日期:2018-06-12      浏览次数:81
    • 磁珠法蛋白纯化越来越受到很多科研小伙伴的青睐,使用磁珠纯化方法比填料柱方法操作更加便捷、磁珠的载量更高、获取的蛋白纯度更高

       

       

       

      在磁珠法蛋白纯化被逐渐接受的同时,有的用户由于刚接触磁珠法蛋白纯化,对于磁珠法的原理、性能不熟悉,导致纯化过程中遇到些问题,今天小编就用户使用磁珠过程中经常遇到的问题,科普一番,开启我们探究磁珠法蛋白纯化失败的真相之旅!

       

      His-tag蛋白纯化磁珠原理
      His-tag蛋白纯化磁珠是在琼脂糖微球的内部填充磁性内核,在表面固定金属离子Ni2+或Co2+,Ni2+或Co2+可以和蛋白His标签中组氨酸形成配位键,将目标蛋白结合到磁珠上,最后通过磁性分离器分离出来。
      纯化结果分析的依据:电泳图、缓冲液配方和蛋白性质
      建议用户用粗蛋白液、流穿液(蛋白结合到磁珠上剩余的液体)、洗涤液、洗脱液跑SDS-PAGE凝胶电泳,以便分析实验结果。
      缓冲液配方中不得不提两个关键物质咪唑浓度和盐离子浓度。
      1.咪唑与标签蛋白竞争结合磁珠表面的金属离子,因此缓冲液中咪唑浓度可以影响获得目的蛋白的纯度和目的蛋白获得率。一般推荐梯度洗脱,获取目的蛋白。
      2.盐离子浓度可以影响蛋白质的溶解度,从而影响蛋白与磁珠的结合能力。稀浓度盐离子可以促进蛋白质的溶解,高浓度中性盐会破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质溶解度降低。

      蛋白纯化失败分析

      一、目的蛋白纯度低
      当纯化得到的目的蛋白纯度低时,可以增加洗涤液中(washing buffer)咪唑浓度。杂蛋白与磁珠结合力比较弱,增加洗涤液中咪唑浓度这样可以将结合在磁珠上杂蛋白洗涤下来。这里有一个典型的例子分享给大家。

      从电泳图中可以看出,当洗涤液中咪唑由60mM增加达到100mM时,杂蛋白不见啦,这一招你get了吗?
      二、目的蛋白量少
      当出现纯化后目的蛋白的量少时,通常有这三种情况:
      1.粗蛋白液中蛋白大部分在沉淀里,上清液中蛋白量少
      解决建议:根据蛋白质性质调节盐离子浓度增加蛋白的溶解度。增加磁珠的量,提高蛋白结合上磁珠的几率。
      2.上清液中蛋白浓度大,流穿液中蛋白浓度也大
      解决建议:说明蛋白没有结合到磁珠上,可以降低咪唑浓度、降低盐离子浓度来增加蛋白与磁珠的结合力。还有一种可能目标蛋白没有his标签,建议Western blot确认标签,重新构建载体。
      3.上清液中蛋白浓度大,流穿液中蛋白浓度少,洗脱液中蛋白浓度低
      解决建议:说明蛋白在磁珠上没有洗脱下来,建议增加洗脱液中咪唑浓度到500mM。或者取洗脱后的磁珠放于沸水中煮5min后,取刚煮过磁珠的液体跑电泳验证。

     
    QQ在线咨询
    联系人
    李经理
    咨询热线
    86-021-61920961
    13916220072
    友情链接:鼎盛彩票  北京赛车pk10中奖规则  北京赛车pk拾杀号  北京赛车pk拾冠军玩法  北京赛车pk10网站制作  

    免责声明: 本站资料及图片来源互联网文章,本网不承担任何由内容信息所引起的争议和法律责任。所有作品版权归原创作者所有,与本站立场无关,如用户分享不慎侵犯了您的权益,请联系我们告知,我们将做删除处理!