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甲基化特异性PCR
  • 发布日期:2018-07-19      浏览次数:213
    • 甲基化特异性PCR

      标签: 甲基化 特异性 PCR

      DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase, Dnmt)催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(mC)的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯yi存在的化学性修饰碱基。

      • 亚硫酸氢钠法
      实验方法原理MSP是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因 组DNA,未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后用3对特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳,凝胶扫描观察分析结果。
      实验材料

      DNA

      试剂、试剂盒

      亚硫酸氢钠、氢醌、石蜡油、乙醇

      仪器、耗材

      水浴锅、PCR仪

      实验步骤

      1.  在50 μl 体系中,DNA(2~5 μg)经NaOH(终浓度值0.2 mol/L)在37℃变性10 Min。

      2.  对于ng级别的人基因组DNA,在进行修饰前加入2μg蛙鱼精DNA为载体。


      3.  加入30 μl 刚配制好的10 mmo/L 氢醌与520/1的40.5%亚硫酸氢钠混匀。

      4.  然后用石蜡油隔绝空气的条件下,避光在50%温育16 h。


      5.  修饰后的DNA过WizerdDNA纯化柱,用50/1 L 水洗脱。

      6.  室温下用NaOH(终浓度为0.3 mol/L)修饰5 min,之后用乙醇沉淀。


      7.  DNA溶于20 μl 水中,立即使用或在-20℃保存。

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